2014年のノーベル化学賞が発表、超高解像度の蛍光顕微鏡開発に対して

2014年10月8日 18:55 │Comments(6)

Written by くまむん

ノーベル賞委員会は8日、2014年のノーベル化学賞を、ハワード・ヒューズ医学研究所のEric Betzig氏、マックプランク研究所のStefan W. Hell氏、スタンフォード大学William E. Moerner氏に贈ると発表しました。

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受賞理由は、”for the development of super-resolved fluorescence microscopy.” となっており、超高解像度の蛍光顕微鏡の開発業績が評価されたものとなっています。

蛍光顕微鏡というのは、文字通り対象サンプルから発生する「蛍光」という光を捕らえることで観察を行う顕微鏡です。あまり聞き慣れない方もいらっしゃるかと思いますが、特にバイオの分野では広く使用されている装置です。

ミクロ〜サブミクロスケールの生体試料(例えば細胞など)を観察する場合、電子顕微鏡を使用すると、装置内を真空にする・サンプルに強烈な電子線を照射するといったことが必要となり、サンプルが物理的に破壊されてしまいます。これに対して、蛍光顕微鏡では、対象を生きたまま破壊することなく観察することが出来る点が、大きなメリットと言えます。

ただ、この蛍光顕微鏡、200nmという分解能が一つの壁となっており、それよりも小さいDNA分子やウイルスなどの “超” 微細構造の観察が難しいといった課題が残っていました。

▼回折限界の関係から、光を使った顕微鏡では200nmが観察限界とされていた。

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スゴい顕微鏡(1): STED顕微鏡

受賞者の一人であるHell氏は2000年、1本のレーザーによってサンプルの分子を励起させ、もう1本のレーザーによってその励起を失活させる技術を用いた「STED (Stimulated Emission Depletion, 誘導放出制御) 顕微鏡」を開発しています。

下にある図を見て頂ければ判りやすいのですが、STEDではまず、従来の蛍光観察で使用されていたようなレーザー光(A)を照射。その外側をドーナツ状に囲むように、別のレーザー(B)を照射しています。

すると、内側にあるレーザー(A)の外縁部はレーザー(B)と相互作用を起こして「誘導放射」という原理に従ってエネルギーを失い、最終的には、レーザー光(A)の中心部のみが残ります。もちろん、周辺を削ぎ落した分だけレーザーの径は細まっているわけですから、これを用いてサンプル表面をスキャンすると、これまでよりも分解能の高い観察が可能になる、というわけです。

▼STED顕微鏡の原理(図はOptipedia様より引用)。ここでは青がレーザー(A)、オレンジがレーザー(B)に相当する。

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▼通常の蛍光観察とSTEDの比較。レーザーのスポット径が大幅に縮小されていることがわかる。

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こうして生まれたSTED顕微鏡は、それまで不可能とされていた生体分子のサブミクロンレベルでの観察を可能にし、蛍光顕微鏡でも光の波長より小さなものを観察することが可能であることを実証しました。

スゴい顕微鏡(2): PALM/STORM

一方、Moerner氏とBetzig氏は、STED顕微鏡とは異なる方向から、ナノレベルの構造観察実現に向けた研究を行っていました。彼らの技術は、サンプル全体に微弱な光を照射した時、サンプルの分子から局所的・確率的に光が発生してくる原理を利用したものです。

前述したように、従来の蛍光顕微鏡でも、200nm程度の大きさであれば対象をとらえることができます。これはすなわち、一つの視野の中で二つの蛍光分子が光っていても、互いの距離が数nm〜数十nmと非常に接近している場合では両者の区別がつきませんが、互いが200nmよりも離れてさえいれば、二つの物体を別々のものとして観察出来る、ということも意味します(とはいえ、それぞれの輝点は分子サイズ以上に “ボヤケて” 見えますが)。

このことから、Moerener氏らの技術ではまず、サンプルを構成している分子から発生してくる蛍光のうち、個々の光が区別できるような一定間隔(ex. >200nm) 以上に離れた輝点のグループをスナップショットとして撮影。それぞれの輝度分布を解析して、蛍光分子の位置をマッピングします。

これらの輝点の組み合わせがサンプル全体を網羅するように、サンプルをわずかに光らせてはスナップを撮影して消し、光らせて撮影して消し、といったプロセスを延々と繰り返し、何万枚もの “断面図” を撮影。最終的に、それらの写真から割り出された蛍光分子の位置を一枚の画像に合成することで、高解像度の観察を可能にしているというわけです(このあたりの詳細な内容については、こちらのサイトが参考になります)。

▼ノーベル委員会による、単分子イメージングの仕組みを表した図。断面図のように撮影された蛍光点のグループを重ねあわせて、一枚の絵に合成してゆく、

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1980年代、Moerner氏はこの原理に関する理論を構築し、89年には世界で初めて単一分子の光吸収を計測することに成功。1997年には、この原理を用いて実際にGFP(緑色蛍光タンパク質)の単分子観察に成功しています。

これらのMoerner氏の手法をベースとした顕微鏡を、2006年にBetzi氏が初めて装置化に成功します。その後、この技術を用いた「PALM (Photoactivated localization microscopy, 光活性化局在顕微鏡法)」や「STORM(STochastic Optical Reconstruction Microscopy, 確率論的光学再構成顕微鏡法)」と呼ばれる次世代の観察技術が登場。ナノレベルの蛍光観察技術が、一気に広まることになります。

▼Betzi氏が2006年に発表した論文中の観察像。右図のスケールバーが0.2μmであることに注目。

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これらSTED/PALMといった超高性能な顕微技術の登場によって、細胞や生体分子を「生きたまま(ありのまま)ナノレベルで」観察することが可能になり、バイオイメージングの分野は飛躍的に進歩しました。

顕微鏡の開発業績および生体分子の観察法開発という、化学賞のイメージとは少し離れた印象のある発表でしたが、近年の学問領域間の融合加速を象徴する出来事といえるかもしれません。

論文はこちら

▼1989年、単一分子の光吸収を報告したMoerner氏らによる論文。
Optical detection and spectroscopy of single molecules in a solid (Phys Rev Lett. 1989 May 22;62(21):2535-2538.)

▼1997年、GFP分子の一分子観察を報告したMoerner氏らによる論文。
On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein (Nature 388, 355-358 (24 July 1997))

▼2000年、STED顕微鏡の技術を報告したHell氏の論文。
Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission (PNAS. 2000 Jul 18;97(15):8206-10.)

▼2006年、装置化したPALM顕微鏡による蛍光観察を報告したBetzig氏による論文。
Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. (Science. 2006 Sep 15;313(5793):1642-5)

[Nobelprize.org]
(※)注釈のない画像については、公式サイトで公開されているPDF資料から引用しています。

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